Wolbachia tiene efectos sutiles sobre la preferencia térmica en Drosophila melanogaster altamente endogámica que varían según la etapa de vida y las condiciones ambientales.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13792 (2023) Citar este artículo

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Las fluctuaciones de temperatura suponen un reto para los ectotermos, que no son capaces de regular la temperatura corporal por medios fisiológicos y, por tanto, tienen que ajustar su entorno térmico mediante el comportamiento. Sin embargo, aún se sabe poco sobre si los simbiontes microbianos influyen en la preferencia térmica (Tp) en los ectotermos al modular su fisiología. Varios estudios recientes han demostrado efectos sustanciales de las infecciones por Wolbachia sobre la Tp del huésped en diferentes especies de Drosophila. Estos datos indican que la dirección y la fuerza de la variación de la preferencia térmica dependen en gran medida de los genotipos del huésped y del simbionte y son muy variables entre los estudios. Mediante el empleo de experimentos altamente controlados, investigamos el impacto de varios factores ambientales, incluida la humedad, la calidad de los alimentos, la exposición a la luz y la configuración experimental, que pueden influir en las mediciones de Tp en moscas adultas Drosophila melanogaster. Además, evaluamos los efectos de la infección por Wolbachia sobre Tp de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo, lo que no se había hecho antes. Encontramos sólo efectos sutiles de Wolbachia sobre el huésped Tp que se ven fuertemente afectados por la variación experimental en adultos, pero no durante las etapas de vida juveniles. Nuestros análisis en profundidad muestran que la variación ambiental tiene una influencia sustancial en la Tp, lo que demuestra la necesidad de un diseño experimental cuidadoso e interpretaciones cautelosas de las mediciones de Tp junto con una descripción exhaustiva de los métodos y equipos utilizados para realizar estudios de comportamiento.

La temperatura modula muchos procesos fisiológicos y tiene efectos directos sobre el desarrollo, la supervivencia y la reproducción de cualquier organismo1,2. Los ectotermos carecen de la capacidad de regular su temperatura corporal por medios fisiológicos y se ven particularmente afectados por la variación de temperatura3. Por lo tanto, su termorregulación a menudo está mediada por el comportamiento4 (Stevenson, 1985), por lo que los ectotermos tienden a ocupar nichos ambientales cercanos a sus condiciones térmicas óptimas para sobrevivir y propagarse. Cada organismo exhibe una preferencia térmica (Tp), que es la temperatura corporal preferida o el rango de temperatura elegido en ausencia de otras limitaciones ecológicas5. Sin embargo, las estimaciones de Tp no son de ninguna manera absolutas, sino que pueden estar fuertemente influenciadas por interacciones con factores ecológicos e incluso con simbiontes. Los endotermos, por ejemplo, combaten las infecciones bacterianas y virales con fiebre aumentando fisiológicamente su temperatura corporal fuera del óptimo térmico de sus agentes infecciosos. Varios estudios muestran que también los ectotermos emplean estrategias de comportamiento similares cambiando su Tp6,7,8,9,10,11. Por ejemplo, los grillos buscan activamente temperaturas más altas cuando están infectados con la bacteria patógena Serratia marcescens, que puede tener efectos fisiológicos similares a la fiebre en respuesta a infecciones patógenas12. Sin embargo, también se ha informado del comportamiento opuesto, es decir, el enfriamiento conductual, en organismos poiquilotermos como mecanismo para combatir patógenos, por ejemplo en Drosophila13.

En particular, tres estudios recientes investigaron cambios de comportamiento térmico en Drosophila melanogaster infectada con el endosimbionte bacteriano Wolbachia14,15,16. Dos de estos estudios encontraron que, dependiendo de la variante Wolbachia, las moscas infectadas elegían temperaturas más frías que los individuos no infectados14,15. Si bien tal respuesta conductual probablemente esté fuertemente influenciada por las condiciones ambientales y experimentales y no por un patrón general16, estos hallazgos pueden sugerir que los huéspedes pueden aliviar los efectos perjudiciales de las infecciones con títulos elevados eligiendo temperaturas ambientales fuera del rango fisiológico óptimo del simbionte. Sin embargo, sigue siendo incierto si tales patrones de comportamiento se limitan a los adultos o también se encuentran en etapas juveniles de la vida. Encontrar la temperatura óptima para el desarrollo es fundamental, ya que cualquier alteración importante durante las etapas juveniles podría disminuir gravemente las posibilidades de supervivencia y reproducción de la imago17. Por lo tanto, manipular la preferencia térmica en esta etapa de la vida del huésped podría ser arriesgado pero beneficioso para el simbionte microbiano, al "establecer" su entorno térmico en las primeras etapas del desarrollo del huésped. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún estudio ha investigado aún los efectos de Wolbachia en Drosophila Tp en las etapas juveniles de la vida.

Medir el comportamiento térmico en Drosophila es complejo y se deben tener en cuenta muchos factores ambientales y el ruido experimental que potencialmente influyen en la Tp. Estos pueden incluir, por ejemplo, factores ambientales como la humedad, la luz, señales olfativas y acústicas, pero también propiedades del diseño experimental, como la edad de las moscas, la temperatura de desarrollo, el número de especímenes y el diseño del aparato que mide la temperatura. preferencia, como se revisó exhaustivamente en Dillon et al.18. Esta cuestión se hace evidente al comparar los resultados divergentes de los tres estudios antes mencionados que evaluaron específicamente la Tp de D. melanogaster en presencia de infecciones por Wolbachia14,15,16. Los valores absolutos de Tp para la misma cepa de Wolbachia varían mucho entre los estudios (hasta 5 a 6 °C), lo que está potencialmente influenciado por diferentes antecedentes genéticos del huésped, condiciones experimentales o rangos de temperatura utilizados en estos estudios. Por lo tanto, evaluar los efectos de diferentes factores ambientales sobre la preferencia térmica en el sistema Wolbachia-Drosophila es crucial para un análisis e interpretación informados de las mediciones de comportamiento.

Aquí, demostramos que varios factores ambientales, como la humedad, los alimentos y la estructura del dispositivo de gradiente térmico tienen un impacto importante en la Tp en moscas adultas D. melanogaster en el contexto de infecciones por Wolbachia específicas de la cepa. Además, investigamos, por primera vez, el efecto de Wolbachia en Tp juvenil y descubrimos que no se ve afectado por la infección en las larvas de mosca tempranas y tardías ni en la puparición.

En nuestros experimentos, utilizamos cuatro cepas de laboratorio de D. melanogaster altamente endogámicas y de larga duración que no estaban infectadas (w-) o estaban infectadas con dos de las variantes naturales más comunes de Wolbachia (wMel y wMelCS) o con la variante de laboratorio wMelPop. que fueron investigados previamente por Truitt et al.14 para la preferencia térmica. Todas las líneas de moscas fueron establecidas inicialmente por Luis Teixeira19 en un entorno isogénico DrosDel w1118. Las moscas se mantuvieron en un medio personalizado a base de agar-agar, melaza y levadura a 24 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h y una humedad promedio del 50%. Antes de los experimentos, el estado de la infección se confirmó mediante PCR utilizando cebadores específicos de Wolbachia que amplificaban partes del gen wsp: forward-tggtccaataagtgatgaagaaactagcta y reverse-aaaaattaaacgctactccagcttctgcac20. Las variantes de Wolbachia que infectan las cepas de moscas se distinguieron con cebadores de PCR de diagnóstico VNTR-141: ggagtattattgatatgcg directo y gactaaaggttattgcat inverso. Los productos de PCR varían en longitud entre las cepas de Wolbachia21.

Para realizar mediciones de Tp en larvas de D. melanogaster, durante la puparia y en moscas adultas, diseñamos y construimos un nuevo aparato de gradiente térmico con dos arenas estrechas para mediciones precisas de temperatura y con espacio limitado para el movimiento a lo largo del gradiente térmico. El dispositivo de “placa” consistía en una placa de aluminio alargada como pieza inferior que descansaba sobre dos elementos Peltier, que se calentaban o enfriaban para generar un gradiente de temperatura. En la parte superior, utilizamos una placa de plexiglás del mismo tamaño como cubierta, que contenía agujeros para aplicar a los sujetos de prueba. Se crearon dos arenas estrechas con 6 mm de alto y ancho colocando tres finos divisores de plexiglás entre las dos placas, que contenían orificios para insertar sensores de temperatura. Restringimos la longitud de la arena a 30 cm agregando tapones de espuma en los extremos de cada carril para evitar que las moscas se escapen y mantener el flujo de aire. Además, se utilizó papel Whatman como capa inferior para cubrir la placa de aluminio de las arenas. Construimos dos dispositivos idénticos con el diseño antes mencionado, lo que nos permitió investigar Tp en cuatro arenas en paralelo durante un ensayo experimental (consulte https://github.com/capoony/DrosophilaThermalGradient para obtener una descripción detallada).

Para las mediciones de Tp en moscas adultas, además diseñamos y construimos un segundo dispositivo de gradiente térmico "tubo" con forma tubular siguiendo a Rajpurohit y Schmidt22 y complementando el diseño descrito en Truitt et al.14. Este aparato constaba de una varilla cilíndrica central de aluminio conectada a bases cuadráticas de aluminio en ambos extremos que conducen el calor desde dos elementos Peltier, que calientan o enfrían. La varilla de aluminio se colocó dentro de un tubo de plexiglás transparente, que dejó un espacio abierto de aproximadamente 4 cm de diámetro. El tubo de plexiglás estaba unido a la varilla de aluminio con cubiertas de teflón que cubrían la pista para moscas por ambos lados. El tubo de plexiglás contenía varios agujeros para insertar moscas y fijar sensores para medir la temperatura. Justo encima de la varilla de aluminio se insertó un papel Whatman para dividir la arena en dos mitades. Las moscas se mantuvieron en la mitad superior, lo que facilitó la obtención de imágenes de la ubicación de las moscas dentro de la arena cilíndrica alrededor de la varilla central desde arriba durante las mediciones de Tp (consulte https://github.com/capoony/DrosophilaThermalGradient para obtener una descripción detallada).

Se conectaron elementos Peltier (P&N Technology, Xiamen Fujian China) que generaban calor a pequeños disipadores de calor (Fischer Electronic, Alemania) conectados a un ventilador (Oezpolat, Alemania) para estabilizar la temperatura. Los elementos Peltier de refrigeración producen un exceso de calor residual y, por lo tanto, se colocaron encima de un disipador de calor más grande (Fischer Electronic, Alemania), que estaba parcialmente sumergido en un recipiente con agua fría que se enfriaba constantemente mediante tuberías que suministraban agua fría desde un baño de agua distante. (fbc630, Fisher Scientific, EE. UU.).

20 minutos antes de cada experimento, conectamos los elementos Peltier a fuentes de alimentación configuradas en 2 V y 3 V para enfriamiento y calentamiento, respectivamente, para estabilizar el gradiente de temperatura dentro del aparato de gradiente térmico. Descubrimos que el gradiente de temperatura se mantuvo estable durante al menos 1 h, lo que generalmente excedió la duración de una ejecución experimental (aproximadamente 20 a 30 minutos). Después de cada experimento, las partes de plexiglás del aparato se limpiaron con jabón y agua caliente para eliminar posibles feromonas y otros olores que pudieran interferir con el comportamiento de preferencia térmica de las moscas.

Cada experimento se llevó a cabo en una habitación oscura y aislada, sin distracciones de ruido o con muy poco ruido. La sala estaba equipada con aire acondicionado para mantener estable la temperatura ambiente entre 21 y 23 °C, que se controlaba constantemente con un registrador de datos. La temperatura dentro de los dispositivos se midió en tres puntos (en el centro y en los bordes frío y caliente) con sensores térmicos digitales (dispositivos analógicos, EE. UU.). Los datos de los sensores térmicos se recopilaron con un script de Python personalizado en una computadora Raspberry pi 3B + (Raspberry Pi Foundation, Reino Unido) en intervalos de 10 segundos y se guardaron como archivos de texto. La posición de las moscas dentro de los dispositivos se evaluó mediante una cámara infrarroja colocada encima del aparato de gradiente térmico. Las imágenes se tomaron cada 30 segundos y se guardaron en la computadora Raspberry pi para cada ejecución. Desarrollamos un script de Python personalizado para estimar la Tp para cada mosca utilizando información de la posición de un individuo en relación con el gradiente de temperatura lineal entre los puntos de medición de temperatura. Las coordenadas de cada mosca individual y de los sensores térmicos se evaluaron manualmente en ImageJ23 en función de imágenes infrarrojas capturadas 20 minutos después del inicio de cada experimento. Los scripts de Python para cuantificar la preferencia térmica a partir de las coordenadas, incluido un conjunto de datos de prueba, una descripción detallada y todas las imágenes sin procesar de los ensayos de preferencia térmica, están disponibles en GitHub (https://github.com/capoony/DrosophilaThermalGradient).

Para evaluar la Tp larvaria, utilizamos larvas tempranas y tardías del tercer estadio, 72 h y 120 h después de la puesta de huevos (AEL), respectivamente, y nos centramos en dos cepas de moscas que no estaban infectadas (w-) o estaban infectadas con wMelCS para determinar la preferencia térmica. experimentos (consulte la sección Líneas de mosca en Materiales y métodos). Para obtener cohortes de larvas estrechamente sincronizadas, mantuvimos de 40 a 50 moscas hembras adultas a 24 ° C en viales de vidrio con el medio durante 3 a 6 h para la puesta de huevos y luego las transferimos a un medio nuevo para recolectar otra réplica. Después de 72 o 120 h, las larvas se trasladaron a una solución de sacarosa al 18% (en H2O d) usando una espátula. Las larvas flotantes se recogieron suavemente con una punta de pipeta cortada de 1 ml y se transfirieron a H2O dH. Después de lavar tres veces con dH2O, las larvas se transfirieron a placas de Petri de plástico vacías (d = 2,5 cm) y se mantuvieron durante 10 a 20 minutos para recuperarse del estrés.

Para las mediciones de Tp, cubrimos el fondo de cada carril en la máquina de gradiente térmico con una capa de 1 mm de gel de agarosa al 2% para crear un ambiente habitable para las larvas que les permitiera arrastrarse libremente. Comenzamos el experimento cuando el gradiente térmico era constante y lineal de 18 a 28 °C (1 °C por 3 cm). Los experimentos se llevaron a cabo en una habitación oscura a 24-25 °C, con 30% de humedad en diferentes momentos del día (de 11 am a 4 pm). Cada ejecución incluyó dos réplicas de las líneas w- y wMelCS. Se introdujeron entre 50 y 100 larvas en el medio de cada carril (23 °C) con un cepillo húmedo y se aplicó una cubierta de plexiglás en la parte superior de la máquina para evitar que las larvas se escaparan. La posición de las larvas se analizó in situ después de 30 minutos cuantificando el número de larvas ubicadas en una determinada zona de temperatura marcada previamente con un bolígrafo.

Para evaluar la Tp en el momento de la puparición, utilizamos larvas tardías del tercer estadio, 140 h después de la puesta de huevos (AEL) cerca de la puparición. Nuevamente, nos centramos en las cepas w- y wMelCS para los experimentos y obtuvimos cohortes sincronizadas de larvas de 140 h como se explicó anteriormente.

Para las mediciones de Tp, cubrimos la parte inferior de los cuatro carriles de la máquina de gradiente con una lámina de plástico negro inodoro de 1 mm de espesor para crear un fondo contrastante y proporcionar una superficie sólida para la puparición. Insertamos larvas cuando el gradiente era constante y lineal de 18 a 28 °C (1 °C por 3 cm). Los experimentos se llevaron a cabo en una habitación oscura a 24-25 °C con 30% de humedad durante aproximadamente 12 h hasta que todas las larvas hubieron pupariado. Cada ejecución incluyó dos líneas replicadas al mismo tiempo (2 veces w- y 2 veces wMelCS). Se introdujeron entre 50 y 100 larvas en el medio del carril (23 °C) con un cepillo húmedo y se usó una cubierta de plexiglás para sellar la parte superior de la máquina para evitar que las larvas salieran de las arenas. La preferencia térmica en el momento de la pupariación se analizó después de 6 a 12 h cuantificando el número de pupas en ciertas zonas de temperatura como se describió anteriormente.

Antes de los experimentos, seleccionamos cohortes de 20 hembras y 20 machos, que tenían 1 semana (± 2 días), para cada una de las cuatro cepas (w-, wMel, wMelCS y wMelPop). Los transferimos a viales de vidrio nuevos con medio aplicando suavemente CO2 y luego dejamos que las moscas se recuperaran durante dos días. Para reducir la posibilidad de un sesgo del experimentador, anonimizamos las identificaciones de las cohortes antes de los experimentos realizados por un investigador independiente. Para cada ensayo en el dispositivo de "placa", incluimos una réplica de las cuatro líneas de moscas y colocamos cada uno de los grupos en uno de los cuatro carriles. Para los experimentos que utilizaron el dispositivo "tubo", llevamos a cabo dos ensayos repetidos en paralelo, utilizando cohortes extraídas al azar. Las moscas se recogieron suavemente del vial con un aspirador de moscas hecho a mano y se transfirieron al aparato de gradiente térmico a través de un orificio en el centro. Luego se selló herméticamente el orificio con algodón, se apagó la luz y se tomaron medidas durante 20 min. Se tomó una imagen de todo el aparato cada 30 s con una cámara infrarroja colocada encima de la configuración.

Debido a que la hora del día puede tener una fuerte influencia en la Tp en Drosophila24, realizamos un máximo de 4 ejecuciones por día para evitar posibles sesgos de los ritmos circadianos. El horario de las carreras durante el día era normalmente el siguiente: las dos primeras carreras de 10 a 12 horas, las dos últimas de 13 a 15.30 horas. Para cuantificar la Tp de moscas individuales en la arena, utilizamos imágenes de la ubicación de las moscas tomadas 20 minutos después del inicio del experimento, similar a Truitt et al.14.

Además de los experimentos descritos anteriormente, intentamos probar cómo la variación ambiental influye en Tp. Tomamos en cuenta cuatro factores diferentes: humedad, luz, comida y tipo de máquina de gradiente. Los cuatro factores se probaron en al menos tres réplicas con el dispositivo "tubo", excepto en el último, donde se utilizaron ambos tipos para comparar. Al probar los efectos de la humedad, utilizamos un humidificador estándar para aumentar la humedad del 30%, que generalmente medimos sin ningún ajuste, hasta una humedad estable del 60% en la sala de prueba. Para probar la influencia de la luz en la preferencia térmica, colocamos la máquina de gradiente en el centro, encima de una lámpara de techo, y realizamos carreras de preferencia térmica con la luz encendida y apagada utilizando diferentes réplicas biológicas. Al probar el efecto de la calidad de los alimentos sobre Tp, mantuvimos las moscas durante al menos tres generaciones con dietas diferentes antes de realizar el experimento. Comparamos los efectos de nuestra receta de comida interna, descrita anteriormente, con la comida instantánea Carolina 4–24, obtenida directamente del fabricante (Carolina, EE. UU.). Para probar cómo el tipo de dispositivo afecta a la Tp, combinamos los datos de las ejecuciones en los dos dispositivos diferentes realizados en la misma habitación con temperaturas ambiente similares para mantener las condiciones ambientales consistentes. El análisis de imágenes tomadas bajo luz infrarroja no permitió distinguir entre sexos. Dado que no se han informado diferencias en Tp en Drosophila melanogaster25,26, no asumimos que ignorar el factor "sexo" conduciría a resultados sesgados.

Los efectos de la infección por Wolbachia y otros factores ambientales sobre Tp se analizaron utilizando modelos lineales mixtos generalizados (GLMM) con una estructura de error de Poisson en R27 basada en la función “glmer” en el paquete lme428. En nuestros modelos, consideramos la Tp de cada individuo como variable dependiente y el tipo de infección como factor fijo. Además, siempre incluimos los experimentos replicados de factores anidados dentro del tipo de infección como factores aleatorios en cada uno de nuestros modelos. Para el experimento de Tp larval, incluimos adicionalmente la edad de las larvas (72 h y 120 h) como un factor fijo y la interacción de la edad de las larvas con el estado de infección en nuestro modelo. Además, para la mayoría de los modelos, incluimos el tiempo de ejecución de cada réplica durante el día como un factor aleatorio. Utilizamos la función anova en R para probar un efecto significativo del estado de infección en la preferencia térmica y calculamos un análisis de desviación Tipo III comparando modelos anidados para probar efectos significativos de factores fijos e interacción en los experimentos de Tp. Siempre que el estado de infección del factor tuvo un efecto significativo, realizamos pruebas post hoc utilizando el método HSD de Tukey implementado en el paquete emmeans30. También inferimos la asimetría de las distribuciones de Tp utilizando el paquete de momentos31 y comparamos la asimetría promedio entre configuraciones experimentales con pruebas de Wilcoxon Rank en R. Todo el código R se puede encontrar en https://github.com/capoony/DrosophilaThermalPreference.

Usando el aparato de gradiente térmico recientemente diseñado (ver Materiales y Métodos), encontramos que Tp en las larvas de tercer estadio temprano (72 h AEL; n = 281) y tardías (120 h AEL; n = 658) se desplazó significativamente de una Tp mediana. de 22–23 °C a una Tp mediana de 19 °C (ver Tabla S1) con progresión del desarrollo (GLMM: p = 2.8e−8, x2 = 34.8, gl = 2; Tabla 1A, Fig. 1A). Nuestros resultados fueron consistentes con hallazgos anteriores32,33. Sin embargo, no observamos un efecto de Wolbachia sobre Tp en larvas de tercer estadio (GLMM; p = 0,34, x2 = 2,1, df = 2; Tabla 1A; Fig. 1A) ni una interacción de Wolbachia con la edad larvaria (GLMM; p = 0,17, x2 = 1,9, gl = 1). Dado que muchas larvas se agruparon en el punto más frío de la pared de la máquina de gradiente (18–19 °C), repetimos el experimento para la clase de edad de 120 h, que exhibió una Tp más baja, y ampliamos el rango de temperatura más bajo a 15 °C. Este análisis ampliado de 529 larvas de tercer estadio infectadas y 332 no infectadas a las 120 h AEL tampoco mostró ningún efecto de la infección por Wolbachia en la Tp del huésped (GLMM: p = 0,38, x2 = 0,76, df = 1; Fig. S1, Tabla 1B ), aunque la Tp mediana disminuyó aproximadamente 1 °C y la mayoría de las larvas de ambos tipos de infección (w- y wMelCS) se agruparon a temperaturas entre 16 y 18 °C (Tp mediana de 18 °C; Tabla S1).

Preferencia térmica (Tp) de larvas de tercer estadio de D. melanogaster infectadas temprana y tardíamente con Wolbachia y larvas al inicio de la puparia. (A) Cambio de temperatura en larvas tempranas y tardías del tercer estadio que no estaban infectadas (w-; gris) o infectadas con wMelCS (rojo), 72 h y 120 después de la puesta de huevos (AEL), respectivamente (ver también Fig. S1 y Tabla 1). (B) Tp de larvas de D. melanogaster al inicio de la pupariación (140 h AEL) para ambos tipos de infección (ver también la Tabla 1). Obsérvese la ausencia de efectos de Wolbachia sobre la preferencia térmica en todos los estadios larvarios.

La pupariación en Drosophila es una etapa crucial del desarrollo durante la cual la mosca queda inmovilizada durante varios días y sufre una metamorfosis completa. Así, para que las larvas se desarrollen adecuadamente, elegir la temperatura óptima de pupariación es de gran importancia18,34. Analizamos el Tp de 192 larvas infectadas y 142 no infectadas a punto de pupariar (140 h AEL; Tabla S1). En comparación con Tp en larvas del tercer estadio tardío (Tp mediana de 18 °C para ambos tipos de infección; Tabla S1), la Tp de pupariación cambió a temperaturas más cálidas (Fig. 1B, Tp mediana de 20 °C para no infectados y 21 °C para los no infectados). C para individuos infectados; Tabla S1). Sin embargo, al igual que con las larvas de tercer estadio, no encontramos ningún efecto significativo de Wolbachia sobre la preferencia térmica en la etapa de pupariación (GLMM: p = 0,64, x2 = 0,21, df = 1; Tabla 1C).

La ausencia de efectos de Wolbachia sobre Tp en larvas de tercer estadio temprano y tardío y sobre Tp de pupariación podría indicar que la infección no impone costos significativos al menos en las etapas de desarrollo investigadas aquí. Podría estar correlacionado con el título bacteriano, que se sabe que influye en la aptitud de la asociación simbiótica cuando alcanza niveles elevados35,36,37,38,39. Aunque se sabe poco sobre la dinámica de los títulos de Wolbachia durante el desarrollo de la mosca y a pesar de los efectos aún no descubiertos de las infecciones por Wolbachia durante el desarrollo larvario, nuestros hallazgos podrían implicar una latencia de la infección en las etapas juveniles del huésped. Strunov et al.37, por ejemplo, demostraron que el título de la cepa patógena wMelPop en D. melanogaster es significativamente menor en las larvas que en la imago y estable durante todo el desarrollo sin ningún efecto de la temperatura de crianza. Sin embargo, se ha observado previamente una influencia de la temperatura en el título de Wolbachia en adultos después de la metamorfosis40,41, lo que indica que puede tener lugar una multiplicación bacteriana y una interacción pronunciada con el huésped durante la etapa tardía de pupariación. De acuerdo con esta hipótesis, se demostró que Wolbachia interfiere con la producción de feromonas en las hembras durante la puparia y afecta la comunicación entre hembras y machos42. Además, dos artículos recientes demostraron la ausencia de efectos de Wolbachia sobre la locomoción y la aptitud física en la etapa juvenil de las moscas D. nigrosparsa43 y D. melanogaster44 capturadas en el medio silvestre. La ausencia de efectos de Wolbachia en los rasgos juveniles del huésped es cuestionada por un estudio que informó una abundancia estable de transcripciones de Wolbachia en todas las etapas del desarrollo del huésped45, aunque no hubo datos sobre la traducción de las transcripciones. Por lo tanto, es de suponer que Wolbachia tiene efectos nulos o muy bajos y no detectados en las moscas en desarrollo. Además, otras señales, como buscar comida46, podrían representar estímulos conductuales más fuertes, que podrían enmascarar efectos sutiles de Wolbachia sobre el comportamiento térmico.

Utilizando nuestra nueva configuración experimental, intentamos reproducir experimentos anteriores que informaron que la infección por Wolbachia puede reducir la preferencia térmica en moscas adultas de D. melanogaster dependiendo de la variante de Wolbachia estudiada14,15, pero ver16. Utilizamos las mismas líneas de mosca, establecidas inicialmente por Teixeira et al.19, tal como las examinaron Truitt et al.14. Investigamos cinco cohortes replicadas de cada línea de moscas (w-, wMel, wMelCS y wMelPop) con nuestro nuevo dispositivo de gradiente térmico en condiciones ambientales altamente controladas. Inesperadamente, no pudimos reproducir los resultados anteriores en Truitt et al.14, ya que ninguna de las líneas difería en la preferencia térmica (GLMM: p = 0,35, x2 = 3,29, gl = 3; Tabla 1D; Fig. 2). La Tp mediana fue de 18,3 °C, 18,8 °C, 18,1 °C y 18,2 °C para w-, wMel, wMelCS y wMelPop, respectivamente (Tabla S1). La variación entre las réplicas fue bastante alta, con una desviación estándar de 2,4 a 3 °C entre la Tp media, según el tipo de infección estudiada.

Preferencia térmica de adultos de D. melanogaster con diferentes tipos de infección. Diagramas de caja que muestran la Tp mediana de moscas que no estaban infectadas (w-) o con tres tipos diferentes de Wolbachia (wMel: azul; wMelCS; rojo y wMelPop: naranja).

Para descartar que la ausencia de variación de Tp entre cepas infectadas con diferentes variantes de Wolbachia sea un artefacto de nuestra configuración experimental, construimos recientemente un dispositivo similar al diseño de Truitt et al.14 y repetimos los ensayos de Tp. En general, la Tp mediana fue aproximadamente 3 °C mayor que las mediciones del dispositivo de “placa” (21,7 °C, 22 °C, 21,5 °C y 21,5 °C Tp promedio para w-, wMel, wMelCS y wMelPop, respectivamente; Tabla S1), que indica una fuerte influencia del diseño en la Tp absoluta (GLMM: p <2.2e−16, x2 = 748.6, df = 4; Tabla 2A). Además, encontramos diferencias significativas entre los tipos de infección (GLMM: p < 0,0044, x2 = 18,88, df = 3; Tabla 2A), aunque en la dirección opuesta según nuestras expectativas: la Tp de la variante wMel aumentó aproximadamente 1 °C en comparación con w- (prueba post hoc de Tukey: p <0,003; Tabla S2). Por el contrario, las variantes wMelCS y wMelPop no mostraron ningún efecto sobre la Tp en comparación con las líneas de control no infectadas (prueba post hoc de Tukey: p > 0,05; Tabla S2), lo que contrasta marcadamente con diferencias sustanciales de Tp (2–4 °C) entre las variantes descritas previamente por Truitt et al.14. Así, a pesar de utilizar un diseño similar para el dispositivo de gradiente térmico al de Truitt et al.14, no pudimos reproducir los resultados obtenidos anteriormente. Mantener las líneas en el laboratorio durante 4 a 5 años con una alta endogamia antes de los ensayos repetidos de gradiente térmico podría haber influido potencialmente en los resultados mediante la acumulación de mutaciones, la reducción de títulos u otros factores genéticos desconocidos47. Además, las diferencias en las condiciones ambientales durante nuestro experimento y los experimentos de Truitt et al.14 pueden confundir fuertemente el comportamiento térmico. Por ejemplo, los experimentos de Truitt et al.14 no fueron controlados por señales de luz ni por los efectos de la humedad o la variación de la temperatura ambiente. Si bien los experimentos de Arnold et al.15 se llevaron a cabo en completa oscuridad, estos ensayos tampoco fueron controlados por la variación de la humedad ni la variación de la temperatura ambiente. Estos factores ambientales pueden tener una fuerte influencia en el comportamiento durante los ensayos experimentales, lo que podría potencialmente anular la variación sutil en la preferencia térmica.

Los análisis presentados anteriormente muestran que el diseño del dispositivo de gradiente térmico juega un papel importante en las mediciones de Tp. El dispositivo tubular constaba de más piezas metálicas de repuesto que el dispositivo de placa, lo que afectó negativamente a la conductividad de la temperatura. En consecuencia, encontramos que el rango de temperatura efectivo a lo largo del gradiente era mucho más estrecho en el dispositivo tubular en comparación con el dispositivo de placa. La temperatura mínima en el tubo nunca bajó de 17 °C (temperatura máxima: 27 °C), mientras que la placa alcanzó temperaturas tan bajas como 13 °C (temperatura máxima: 27 °C). Por lo tanto, probamos si las moscas estaban limitadas por el rango de temperatura y no podían elegir temperaturas preferidas por debajo de la temperatura mínima en el tubo. En este caso, las moscas pueden agruparse en el extremo inferior del gradiente en el dispositivo de tubo, lo que daría como resultado distribuciones de Tp sesgadas hacia el extremo inferior, en comparación con el dispositivo de placa. Sin embargo, al comparar la asimetría de las distribuciones de Tp en experimentos replicados entre los dos dispositivos, no encontramos diferencias significativas (prueba de rango de Wilcoxon, W = 258, p = 0,128), lo que sugiere que el rango de temperatura dentro del tubo no limitó el comportamiento de la prueba vuela.

Por el contrario, temperaturas frías de hasta 10 a 13 °C pueden provocar una reducción de la velocidad48, lo que puede provocar inmovilización49,50 como respuesta fisiológica. Por tanto, esto puede dar como resultado mediciones de Tp sesgadas debido a un grupo de moscas inmovilizadas que quedan atrapadas en el extremo frío del gradiente18. Al igual que Hague et al.16, repetimos las pruebas de la influencia de Wolbachia en la Tp en moscas en el dispositivo de placa excluyendo las moscas con una Tp < 15 °C, para evitar un sesgo potencial debido a una movilidad reducida en temperaturas frías. El análisis basado en este conjunto de datos reducido tampoco indicó una influencia específica de Wolbachia en la Tp del huésped (GLMM: p = 0,43, x2 = 2,76, df = 3) y, por lo tanto, no difirió cualitativamente de los resultados basados ​​en el conjunto de datos completo. Esto sugiere que es poco probable que el atrapamiento debido a la inmovilización en el extremo frío del gradiente sea un factor de confusión en nuestros experimentos.

Especulamos que también otros factores ambientales asociados con el diseño de los dispositivos pueden afectar fuertemente el comportamiento térmico. Según Dillon et al.18, el sexo, la edad, la humedad, la luz, los ritmos circadianos, el estado alimentario y el número de individuos evaluados a la vez influyen en el comportamiento térmico. Si bien se probaron números similares de moscas simultáneamente durante cada experimento en ambos dispositivos, el espacio disponible para cada mosca difería dramáticamente entre los dos diseños. En particular, el espacio más estrecho en el dispositivo de placa puede haber llevado a interacciones más fuertes entre las moscas, lo que podría resultar en un gregarismo y agrupamiento pronunciados debido a interacciones sociales en ciertas regiones a lo largo de las arenas51. Para investigar más a fondo cómo el diseño experimental influye en la medición de Tp, comparamos 15 estudios sobre el comportamiento térmico en moscas D. melanogaster. Este metanálisis cualitativo reveló una alta variación en la Tp medida, que aparentemente depende del diseño del dispositivo de gradiente, el rango o gradiente de temperatura, las condiciones experimentales y de cría, la alimentación, la edad de las moscas y el número de individuos evaluados (todo resumido en la Tabla S3).

Para comprender mejor la influencia de estímulos ambientales específicos en los ensayos de preferencia térmica, investigamos experimentalmente cómo la humedad, los alimentos y la luz afectan la medición de Tp en el contexto de diferentes estados de infección por Wolbachia. Observamos un efecto altamente significativo de la humedad (GLMM: p <2.2e−16, x2 = 266.93, df = 4; Tabla 2B; Fig. 3) sobre la Tp de moscas adultas. Una humedad más alta (60%) resultó en un aumento de las preferencias térmicas, elevadas entre 1 y 2 °C (Tabla S2). La Tp mediana con un 30% de humedad osciló entre 21,5 °C (wMelCs y wMelPop) y 22 °C (w-), mientras que la Tp mediana con un 60% de humedad osciló entre 22,7 °C (w-) y 23,5 °C (wMel, wMelCS). Ya se observó de manera similar una correlación positiva entre la humedad y la Tp en otros insectos52,53.

La influencia de factores ambientales y experimentales sobre Tp en Drosophila melanogaster infectada con Wolbachia. Diagramas de caja que muestran la influencia del diseño del dispositivo de gradiente térmico, la humedad, los alimentos y la luz en la medición de Tp en D. melanogaster y la influencia de Wolbachia en la preferencia térmica del huésped, donde los colores resaltan los diferentes genotipos de Wolbachia.

La dieta también tuvo una fuerte influencia sobre el comportamiento térmico. Descubrimos que las moscas que consumían alimentos internos preferían temperaturas 1 °C más bajas que sus contrapartes mantenidas con alimentos instantáneos de Carolina (GLMM: p = 5,79e-6, x2 = 24,2, df = 2; Tabla 2C; Fig. 3). Se sabe que las diferencias en la calidad de la dieta o el estado alimentario (alimentado versus en ayunas) influyen en la preferencia térmica en los ectotermos, donde una dieta rica en alimentos aumenta la Tp en comparación con una mala alimentación o condiciones de ayuno54,55,56,57. Nuestros resultados coinciden con estos hallazgos anteriores. Si bien no evaluamos la composición exacta de nutrientes en nuestro alimento interno para moscas, la receta se considera menos rica en carbohidratos y proteínas que el alimento instantáneo Carolina 4–24. Además, también se sabe que la dieta afecta el título de Wolbachia en diferentes tejidos: se ha descubierto que los alimentos ricos en proteínas aumentan los niveles de título en los tejidos somáticos, pero no en los ovarios. Por el contrario, los alimentos ricos en carbohidratos pueden aumentar los niveles de títulos sólo en los ovarios58,59. Si la variación en los niveles de título puede tener una fuerte influencia en la preferencia térmica, como se especuló anteriormente14,16, la calidad de los alimentos puede influir indirectamente en la Tp al modular los niveles de título. Sin embargo, no pudimos observar una influencia significativa de la luz en Tp (GLMM: p = 0,059, x2 = 5,69, df = 2; Tabla 2D; Fig. 3).

Curiosamente, en contraste con los experimentos realizados en nuestro dispositivo de gradiente de "placa" recientemente diseñado, los experimentos de seguimiento en el "tubo", en particular el experimento que prueba los efectos de la variación de la humedad, revelaron efectos significativos de las infecciones por Wolbachia en Tp ( ver Tabla 2A). Sin embargo, los patrones observados fueron contrarios a las expectativas. Las moscas infectadas con wMelCS prefirieron temperaturas más cálidas que las moscas no infectadas en ambos experimentos (prueba post hoc de Tukey: p <0,01; Tabla S2; Fig. 3). Estos hallazgos contradicen los resultados observados previamente en los que las moscas infectadas con la variante wMelCS preferían temperaturas más bajas que sus contrapartes no infectadas14,15. Sin embargo, nuestros resultados están en línea con los datos observados por Hague et al.16, que no muestran ningún cambio de preferencia hacia temperaturas más altas en moscas infectadas artificialmente con wMelCS. En resumen, estos resultados sugieren además que la medición de Tp está fuertemente influenciada por la configuración experimental y que la variación de Tp con respecto a las infecciones por Wolbachia es probablemente muy sutil.

En nuestros ensayos de comportamiento térmico encontramos que Wolbachia no influye en la preferencia térmica en las larvas de Drosophila de tercer estadio temprano y tardío, lo que coincide con estudios previos que sugieren que Wolbachia no tiene efectos, o solo tiene efectos muy débiles, sobre los rasgos juveniles de D. melanogaster. Por el contrario, encontramos efectos sutiles de Wolbachia sobre la preferencia térmica en adultos de D. melanogaster solo bajo ciertas condiciones experimentales. Estos efectos fueron inconsistentes con datos anteriores e indican que los ensayos de medición de Tp están potencialmente influenciados y confundidos por señales ambientales no controladas. Estos estímulos conductuales no deseados pueden anular diferencias sutiles de preferencia térmica durante los experimentos de comportamiento. Como mostramos en nuestro estudio, factores como la humedad, la dieta y el diseño del dispositivo de gradiente influyen sustancialmente en las mediciones de preferencia térmica en D. melanogaster infectado con diferentes variantes de Wolbachia. Nuestros hallazgos demuestran la necesidad de un diseño experimental cuidadoso e interpretaciones cautelosas de las mediciones de Tp junto con una descripción detallada de los métodos y equipos utilizados para realizar estudios de comportamiento. Por lo tanto, nuestros datos y hallazgos brindan consideraciones importantes al planificar futuros ensayos de comportamiento para evaluar la preferencia térmica no solo en Drosophila sino también en otros insectos infectados con Wolbachia, como vectores de enfermedades humanas como los mosquitos.

Todos los datos sin procesar y el código R para realizar los análisis estadísticos se pueden encontrar en los archivos de información complementaria Strunov_etal_WolbTP_2023_RawData.xlsx y Strunov_etal_WolbTP_2023_Rcode.zip, respectivamente. Puede encontrar una descripción más detallada de los dispositivos, métodos y enfoques estadísticos utilizados en este manuscrito en línea en https://github.com/capoony/DrosophilaThermalGradient.

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Estamos especialmente agradecidos a Wolfgang Miller, quien ayudó con el diseño del experimento, quien proporcionó espacio de laboratorio y apoyó conceptualmente este proyecto. También estamos en deuda con Marcel Freund de la Universidad de Zúrich, quien no solo fabricó a mano los dispositivos de gradiente térmico utilizados en este estudio sino que también ayudó con su diseño. Además, agradecemos a Thomas Flatt, Elisabeth Haring y Roman Arguello por sus útiles comentarios sobre versiones anteriores de este manuscrito y sobre el conjunto de datos. Estamos muy agradecidos a Fabian Gstöttenmayr, Janis Jeschgo, Julia Mrs, Elina Koivisto y Jasmin Jester que ayudaron con el mantenimiento de las moscas y la preparación de alimentos para las moscas. Este proyecto fue financiado por una subvención independiente del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF P32275) a Martin Kapun.

Centro de Anatomía y Biología Celular, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria

Antón Strunov, Charlotte Schoenherr y Martin Kapun

Laboratorios centrales de investigación, Museo de Historia Natural de Viena, Viena, Austria

Martín Kapun

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AS involucrado en la conceptualización, investigación, curación de datos, visualización, análisis formal, validación, redacción (borrador original); CS involucrado en investigación, curación de datos y redacción: revisión y edición; MK participó en la conceptualización, análisis formal, visualización, supervisión, adquisición de fondos, redacción, revisión y edición y administración de proyectos.

Correspondencia a Anton Strunov o Martin Kapun.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Strunov, A., Schoenherr, C. y Kapun, M. Wolbachia tiene efectos sutiles sobre la preferencia térmica en Drosophila melanogaster altamente endogámica que varían según la etapa de vida y las condiciones ambientales. Informe científico 13, 13792 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40781-7

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Recibido: 31 de marzo de 2023

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 23 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40781-7

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